流式细胞术——原理、操作及应用(第二版)主要介绍流式细胞术的原理、操作及应用，分为概述、流式细胞仪的原理、流式图、流式细胞术的基本操作与技巧、流式分析术的应用和流式分选术的应用6个部分。概述部分介绍基本概念和几款常见的流式细胞仪；原理部分具体介绍流式细胞仪的液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统；流式图部分主要介绍了流式通道、流式直方图、流式散点图和流式等高线图；操作部分介绍了样品制备、荧光素偶联抗体及标记、光电倍增管电压设定、对照设置、补偿调节、阈值设定、死细胞问题处理、分选模式选择、上样速度控制、分选设门原则、分选基本步骤等内容；流式分析术的应用部分具体介绍了流式细胞术在免疫学方面的应用，并且扩展到基础医学和生物学方面的应用；流式分选术的应用部分阐述了不同条件下流式分选的策略选择和注意事项，同时还介绍了各种干细胞包括肿瘤干细胞等的流式分选方法。
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深入浅出，通俗易懂；操作的全面性；理论联系实践；加强了流式分选的相关内容。
曹雪涛，中国工程院院士，现任中国医学科学院院长、北京协和医学院校长。中国免疫学会理事长，医学免疫学国家重点实验室主任，全军免疫与基因治疗重点实验室主任，“长江计划”特聘教授，国家免疫学重点学科带头人，国家杰出青年科学基金获得者，国家973免疫学项目首席科学家，863计划医药生物技术领域专家，国家自然科学基金免疫学重大项目和创新团队项目负责人，国务院学位评议委员会学科评议组委员。
目录
序 i
第二版前言 v
第一版前言 vii
1 概述 1
1.1 流式细胞术基本概念 2
1.2 分析型流式细胞仪介绍 5
1.3 分选型流式细胞仪介绍 9
参考文献 13
2 流式细胞仪的原理 14
2.1 液流系统 15
2.2 光路系统 18
2.3 检测分析系统 28
2.4 分选系统 32
参考文献 37
3 流式图 39
3.1 流式通道 40
3.2 流式直方图 41
3.3 流式散点图 45
3.4 流式等高线图 48
参考文献 50
4 流式细胞术的基本操作与技巧 51
4.1 样品制备 52
4.1.1 独立细胞样品制备 52
4.1.2 免疫器官样品制备 54
4.1.3 实体脏器样品制备 55
4.2 荧光素偶联抗体及其标记方法 56
4.2.1 荧光素 57
4.2.2 荧光素偶联抗体 61
4.2.3 样品封闭 62
4.2.4 荧光素偶联抗体标记 64
4.3 光电倍增管电压设定 66
4.4 对照的设置 71
4.4.1 阴性对照的设置 71
4.4.2 FMO对照 73
4.4.3 阳性对照的设置 74
4.5 补偿调节 75
4.5.1 补偿调节的原理 75
4.5.2 调节补偿的具体方法 76
4.5.3 三色和四色分析补偿调节方法 79
4.5.4 影响补偿大小的因素 82
4.6 阈值设定 84
4.7 流式分析中的死细胞问题 85
4.7.1 减少样品中死细胞比例的方法 86
4.7.2 流式分析时区分死细胞和活细胞的方法 86
4.8 流式分选模式选择 91
4.8.1 纯化模式 92
4.8.2 富集模式 93
4.8.3 单细胞模式 93
4.9 上样速度控制 94
4.9.1 流式分析速度控制 95
4.9.2 流式分选速度控制 95
4.10 分选设门基本原则 97
4.11 流式分选基本步骤 99
参考文献 100
5 流式分析术的应用 102
5.1 细胞群比例测定 103
5.2 表型测定 109
5.3 检测细胞因子 115
5.3.1 胞内染色法检测细胞因子 116
5.3.2 胞内染色法与ELISA法比较 123
5.3.3 CBA法测定细胞因子 125
5.3.4 CBA法与ELISA法比较 127
5.4 检测细胞增殖 128
5.4.1 相对计数法 129
5.4.2 示踪染料标记法 133
5.4.3 BrdU和EdU掺入法 138
5.4.4 其他方法 141
5.5 检测细胞凋亡 142
5.5.1 annexin V/PI双染色法 142
5.5.2 SYTO/PI双染色法 145
5.5.3 细胞DNA含量分析法检测细胞凋亡 146
5.5.4 线粒体损伤检测法 147
5.5.5 活化的caspase-3检测法 151
5.5.6 荧光素偶联的caspase抑制剂(FLICA)标记法 151
5.5.7 甲酰胺诱导ssDNA单抗检测法 152
5.5.8 TUNEL法 153
5.6 检测细胞周期 154
5.6.1 非特异性核酸荧光染料标记法 154
5.6.2 特异性细胞周期调节蛋白检测法 159
5.7 检测细胞杀伤能力 160
5.8 检测细胞吞噬功能 166
5.9 检测胞内活化的激酶 168
5.10 检测细胞自噬 169
5.11 检测基因表达 171
5.11.1 GFP报告基因系统 171
5.11.2 lacZ报告基因系统 172
5.11.3 β-内酰胺酶报告基因系统 173
5.11.4 新型膜结合型报告分子系统 174
5.12 检测细胞内两种蛋白质的直接结合 174
5.12.1 荧光共振能量转移结合流式细胞术检测两种蛋白质的直接结合 174
5.12.2 双分子荧光互补结合流式细胞术检测两种蛋白质的直接结合 176
5.13 微生物学中的应用 177
5.13.1 荧光素偶联抗体直接检测法 178
5.13.2 抗体结合人工荧光微球直接检测法 179
5.13.3 微生物活性流式检测 179
5.13.4 人工微球荧光免疫试验检测抗体 180
5.13.5 荧光原位杂交流式检测法 181
5.13.6 PCR免疫微珠法 182
5.13.7 原位PCR杂交流式检测法 182
5.14 检测钙相关分子 183
5.14.1 检测细胞内游离的钙离子水平 183
5.14.2 检测钙蛋白酶活性 184
5.14.3 检测细胞膜钙泵活性 186
5.15 表观遗传学中的应用 188
5.15.1 ChIP-on-beads法 189
5.15.2 检测细胞水平组蛋白修饰情况 191
5.16 检测缝隙连接介导的细胞通讯 191
5.17 检测细胞内pH值和钠氢转运体活性 194
5.17.1 检测细胞内pH值 194
5.15.2 检测钠氢转运体活性 196
5.18 其他应用 197
5.18.1 检测活性氧簇 197
5.18.2 检测细胞内游离的锌离子水平 198
5.18.3 检测端粒长度 199
5.18.4 检测脂筏结合蛋白 201
引文目录 203
参考文献 207
6 流式分选术的应用 211
6.1 流式分选与磁性分选 212
6.2 流式分选独立群体细胞 214
6.3 流式分选非独立细胞群体 216
6.4 流式分选低比例细胞群体 220
6.4.1 强势细胞群的辐射影响 220
6.4.2 流式分选结合磁性分选 221
6.4.3 二次分选法 222
6.5 流式分选干细胞 224
6.5.1 流式分选造血干细胞 224
6.5.2 流式分选侧群干细胞 229
6.5.3 流式分选间充质干细胞 231
6.5.4 流式分选肿瘤干细胞 232
参考文献 235
1概述
流式细胞术(flow cytometry)是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术，主要包括流式分析和流式分选两部分。流式细胞仪通过接收激光照射液流内细胞后的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。流式细胞仪的出现和流式细胞术的发展是多学科领域共同发展的结晶，其中涉及细胞与分子生物学和生物技术、单克隆抗体技术、激光技术、荧光化学、光电子物理、流体力学、计算机技术等。
流式细胞术主要应用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，应用流式细胞术测定外周血CD4 T细胞的数量能用于监测HIV感染者疾病的进展，开启了流式细胞术应用于临床的新纪元。随后，利用流式分选干细胞过继回输用于疾病的治疗，进一步拓展了流式细胞术的临床应用。现在，流式细胞术还能辅助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。
?1.1??流式细胞术基本概念
1. 原理
特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流内的细胞，产生的光信号被多个接收器接收，一个是在激光束直线方向上接收到的散射光信号(前向角散射)，其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号，包括散射光信号(侧向角散射)和荧光信号。液流中悬浮的直径从0.2~150μm的细胞或颗粒能够使激光束发生散射，细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收，根据接收到的信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。
2. 流式细胞术的三大要素
流式细胞术有三大要素，分别为流式细胞仪、样品细胞和荧光染料或者荧光素偶联抗体。流式细胞术是在流式细胞仪上操作的，流式细胞仪根据其功能的不同可以分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪，前者只能流式分析，不能分选纯化目标细胞，后者能够同时进行流式分析和流式分选。
流式细胞术检测的对象是细胞，而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，即单细胞悬液。流式细胞术不能直接检测组织块中的细胞，要检测脏器或组织中的细胞，必须先用各种方法将脏器或组织制备成单细胞悬液，然后标记上荧光素偶联抗体，才能被流式细胞仪检测。
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